Il Ducato di Bari comprendeva, oltre ai territori del circondario barese anche Ostuni e Villanova che furono ottenuti da Isabella nel 1507 in cambio della Contea di Borrello e della Signoria di Rosarno.

Ad Ostuni, per volere di Isabella, vennero fortificate le mura e per evitare gli attacchi dei Turchi, la regina Bona, ordinò la costruzione di torri di avvistamento lungo la costa – tra le quali si ricordano Torre Pozzella, Torre del Pilone e Torre di Villanova – dalle cui sommità, in caso di pericolo, venivano fatti brillare fuochi in segno di avvertimento.

Qui la regina Bona favorì il commercio del pregiato olio di oliva prodotto per il commercio del quale i milanesi erano stati esentati dalla tassa di piazza tanto che un piccolo porto come quello di Villanova divenne ben presto molto frequentato dalle marsiliane milanesi.

Nel 1556, al suo ritorno in Puglia, la regina Bona volle visitare Ostuni interessandosi della necessità del territorio soggiornando, probabilmente, nel palazzo reale che oltre ad ospitare i regnanti veniva usato anche dai vescovi i quali, con il passare dei secoli, se ne impossessarono. Fu così che, nel 1560, al posto del palazzo reale fu edificato il Palazzo del Vescovo a sua volta sostituito, nel settecento, dall’attuale struttura. Sul portone di ingresso al Palazzo è visibile uno stemma araldico con le arme degli Sforza di Milano e degli Aragonesi di Napoli con incisa l’iscrizione: «CUM UMBRA ALARUM TUARUM PROTEGE NOS» [Sotto l’ombra delle tue ali proteggici].

Nel 1557, poco prima della sua morte, la regina Bona ordinò al Carducci, autorità del luogo, di distribuire ai poveri di Ostuni 100 tomole di grano in onore della Madonna.

Alla morte della regina Bona Ostuni e Villanova, insieme a Grottaglie, ritornarono sotto la giurisdizione della Corte di Napoli.